Microbiologie alimentaire

Des traitements physiques et chimiques peuvent être appliqués sur les matières premières afin de limiter la population microbienne initialement présentes. Ces traitements peuvent aussi être appliqués sur les produits finis dans le but d’augmenter leur durée de conservation.

La cinétique de destruction des microorganismes suit une fonction logarithmique. Cette vitesse de destruction est fonction du microorganisme. On considère toujours les microorganismes les plus résistants vis-à-vis du traitement employé.
A partir de la courbe $\rm \log(N) = \mathcal f(t)$, on définit le temps de réduction décimal $\bf D$ qui est le temps nécessaire pour diminuer d’un facteur $10$ la population microbienne totale ; ce qui correspond à $90\%$ de mortalité.

La température

Le traitement thermique est la méthode la plus répandue car il détruit les microorganismes et les exotoxines. Il peut s’appliquer sur les matières premières et les produits finis et il présente une innocuité pour le consommateur. 

L’élévation de température, par chaleur humide, dénature les membranes biologiques et la plupart des macromolécules. La chaleur humide détruit facilement les bactéries, les mycètes et les virus. On utilise alors un autoclave.
La chaleur sèche provoque la mort des cellules microbienne part dénaturation des protéines et des structures cellulaires. Elle est moins efficace que la chaleur humide pour détruire les microorganismes. On utilisera donc des températures beaucoup plus élevées ($\rm 160°C - 180°C$) et un four Pasteur. 

A partir du temps de réduction décimal, on peut déterminer la valeur du facteur de réduction décimal $\bf z$ qui correspond à l’augmentation de température nécessaire pour réduire $\rm D$ d’un facteur $10$ ; c’est-à- dire détruire $10$ fois plus vite les microorganismes présents.

En industrie, on utilise la valeur pasteurisatrice ou stérilisatrice $\bf{F_t}$ qui représente le temps nécessaire pour éliminer suffisamment de microorganismes à une température donnée. $\rm F_t = n \times D_t$ avec $\rm n$ : nombres de réduction décimale que l’on souhaite détruire. La valeur de $\rm n$ est fixée par la norme. On utilise alors un barème temps-température établi par des organismes agréés. 

On définit trois types de procédés :

• La pasteurisation : Traitement thermique (entre $60$ et $\rm 100°C$) ayant pour but de détruire la totalité des microorganismes pathogènes non sporulés et de réduire significativement la flore végétative présente dans un produit.
• La stérilisation : Traitement thermique ($\rm > 100°C$) ayant pour but de détruire la totalité des microorganismes sous forme végétative ou sporulée présents dans un produit ainsi que les toxines et les enzymes produites par ces microorganismes. 
• L’appertisation : Procédé associant un traitement thermique ($\rm > 100°C$) et un emballage étanche permettant une conservation des aliments et de leurs qualités nutritionnelles sur de longue durée, à température ambiante. L’appertisation permet des durées de conservation très importante : 5 ans maximum pour les conserves.

Le froid est un procédé bactériostatique. 

• Le froid positif (réfrigération) empêche la multiplication des germes mésophiles mais n’inhibe pas les germes psychrophiles et psychotropes. 
• Le froid négatif (congélation, surgélation) stoppe la multiplication de tous les microorganismes.

Lors d’une remontée des températures ou lors du retour à température ambiante, la multiplication des germes reprend.

L’activité de l’eau

L’accessibilité à l’eau est représentée par l’activité de l’eau.
L’activité de l’eau est le $\%$ d’eau libre dans un aliment qui est disponible pour la croissance. Les $\rm A_w$ optimales de croissance sont de :

• $0,91$ à $0,99$ pour les bactéries,
• $0,88$ à $0,99$ pour les levures,
• $0,80$ à $0,99$ pour les moisissures.

Le sel (salaison) et le sucre (confiture) diminuent les activités enzymatiques et la multiplication bactérienne par diminution de l’$\rm A_w$.

Différents procédés permettent d’éliminer l’eau des aliments pour augmenter leur conservation : concentration (filtration ou centrifugation), déshydratation, lyophilisation, séchage, atomisation.

La teneur en $\bf{O_2}$

Les activités enzymatiques et la multiplication bactérienne sont ralenties par diminution de la teneur en $\rm O_2$.
On peut modifier l’atmosphère de conservation en conditionnant les denrées alimentaires : sous film, sous atmosphère protectrice ou sous vide.

Les conservateurs chimiques

Des composés chimiques non toxiques peuvent être utilisés pour leurs propriétés bactériostatiques.

• Les additifs alimentaires comme les nitrites, 
• Les acidifiants diminuent l’activité enzymatique et la multiplication bactérienne par dénaturation des protéines.
• Les bactériocines comme la nisine, 
• Les solutions chlorées diluées pour limiter le développement des flores de surface.

Les radiations

Les radiations peuvent être utilisées pour détruire les microorganismes.

• Les radiations $\rm UV$ et les radiations ionisantes (rayons $\rm X$, rayons $\gamma$) à faibles doses produisent des mutations sur l’ADN. 
• Les radiations ionisantes (rayons $\rm X$, rayons $\gamma$) à plus fortes doses dénaturent les macromolécules et favorisent l’apparition de dérivés actifs de l’oxygènes bactéricides.
  

1. Les laits fermentés
   

Le Codex Alimentarius norme $\rm n°A-11$ (a) (1975) définit le yaourt : « Le yaourt est un produit laitier coagulé obtenu par fermentation lactique grâce à l'action de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus et de Streptococus salivarius subsp. Thermophilus à partir du lait frais ainsi que du lait pasteurisé (ou concentré, partiellement écrémé, enrichi en extrait sec) avec ou sans addition (lait en poudre, poudre de lait écrémé, etc.). Les microorganismes du produit final doivent être viables et abondants. »

Lorsque l’on ensemence le lait avec ces deux bactéries :

• Le pH du lait ($6,6-6,8$) est favorable à la croissance de Streptococcus thermophilus qui assure le départ de la fermentation lactique produisant de l’acide formique et du $\rm CO_2$.
• L’acide formique produit entraine une diminution de pH favorable pour la croissance de Lactobacillus bulgaricus. Lactobacillus bulgaricus poursuit la fermentation jusqu’à un pH d’$\approx 4,3-4,2$. De plus, par protéolyse, Lactobacillus bulgaricus libère des acides aminés à partir des caséines.
• Ces acides aminés sont des facteurs de croissance pour Streptococcus thermophilus. 

L’association des deux bactéries permet d’abaisser le pH du lait au point isoélectrique de la caséine (pH $4,6$) de façon à former un gel (ou coagulum).
Lors de la fermentation du lactose, les bactéries lactiques produisent de l’acide lactique qui donne un goût acidulé au gel et des composés aromatiques qui lui donnent sa saveur caractéristique.
D’autres bactéries lactiques telles Lactobacillus, Bifidobacterium ou des levures lactiques permettent d’obtenir différents laits fermentés

2. Les boissons alcoolisées
   

La souche la plus couramment utilisée appartient au genre Saccharomyces cerevisiae. C’est de la biomasse valorisée issue de l’agriculture, des sucreries ou du lactosérum. Les souches sont sélectionnées selon plusieurs critères :

• La stabilité génétique,
• La capacité de produire rapidement de grande quantité d’éthanol, 
• Leur résistance à l’éthanol,
• La capacité de se développer sur des substrats peu chers,
• La production de composés volatils.

En brasserie, les levures sont ensemencées dans un moût stérile alors qu’en vinification, les levures sont ensemencées dans un moût brut non stérilisé. C’est pourquoi, lors de la production de vin, c’est la flore de surface présente sur la surface des raisins qui débute la fermentation alcoolique. Un vin est considéré comme stable lorsqu’il ne contient plus de sucres fermentescibles et d’acide malique. Il y a donc une double fermentation : la fermentation alcoolique par Saccharomyces cerevisiae et la fermentation malolactique par les bactéries lactiques.
Après la fermentation, les levures sont généralement éliminées par filtration ou décantation.
En brasserie, la bière est obtenue à partir d’un moût de céréales germées additionnées de houblon. Saccharomyces cerevisiae effectue la fermentation alcoolique en deux étapes entrecoupées par une filtration.
Saccharomyces cerevisiae peut aussi fermenter du jus de pommes ou du jus de poires. Cette fermentation alcoolique est associée à l’action des bactéries lactiques initialement présentes sur les fruits.

3. La panification
   

Lors de la fermentation, Saccharomyces cerevisiae libère du dioxyde de carbone qui fait augmenter le volume de la pâte. 

$$\rm 1~Glucose \rightarrow 2~CO_2 + 2~C_2H_5OH$$

Au cours de cette fermentation, plus de $60$ composés aromatiques sont aussi formés sous l’action des levures et des bactéries du levain.

1. FMAT : Flore mésophile aérobie totale
   

$=$ ensemble de microorganismes capables de se multiplier en aérobiose. Leur optimale de croissance est comprises entre $\rm + 20°C$ et $\rm + 45°C$.
En microbiologie alimentaire, on dénombre les microorganismes capables de se développer en $72$ heures à $\rm 30°C$. Ce dénombrement est réalisé sur une gélose ordinaire. Seuls les germes non exigeants sont alors détectés.
Le dénombrement de la flore mésophile aérobie totale permet d'estimer la qualité hygiénique des aliments. La présence en grande quantité de microorganismes aérobies mésophiles indique une dégradation de l’aliment. La modification des propriétés organoleptiques de l’aliment est proportionnelle à la quantité de microorganismes aérobies mésophiles présents. Une $\rm FMAT > 10^6$ à $\rm 10^8 ~microorganimes/g$ d’aliment provoque une détérioration visible du produit.
 Aussi, on considère qu’il ya un risque sanitaire pour le consommateur si la $\rm FMAT$ est $\rm \geq 10^5~ microorganimes/g$ d’aliment.

2. Flores indicatrices de contamination fécale
   

La présence d’une flore indicatrice de contamination fécale est un signe de l’altération de la qualité sanitaire du produit.
Les flores indicatrices de contamination fécale sont des microorganismes de la flore commensale de l’intestin de l’homme et des animaux.

Les flores indicatrices de contamination fécale sont regroupées en trois groupes : 

• Les coliformes et les coliformes thermotolérants (Escherichia coli)
• Les streptocoques fécaux
• Les Clostridium sulfitoréducteurs

Critères pour le choix d’une flore indicatrice de contamination fécale :

• Le microorganisme choisi doit apparaître en plus grande quantité que les germes pathogènes.
• La durée de vie dans le milieu extérieur du microorganisme choisi doit être supérieure à celle des germes pathogènes.
• La bactérie indicatrice de contamination fécale doit pourvoir être mise en évidence, dénombrée et identifiée par méthodes d’analyse simples et fiables.

3. Flores d’altération
   

Certains microorganismes détériorent les aliments pendant leur durée de conservation alors que d’autres sont responsables d’accidents de fabrication.

La prolifération des microorganismes dans les aliments peuvent altérer leurs qualités organoleptiques et leur valeur marchande : 

• Modification de l’aspect et la texture par digestion des macromolécules et par production de substances colorantes,
• Modification de la flaveur (goût et odeur) par libération de substances volatiles,
• Détérioration du contenant par production de gaz,
• Diminution de la valeur nutritionnelle par dégradation des macromolécules.

La flore lipolytique possède des lipases qui hydrolysent la matière grasse. Elle est responsable de l’apparition de composés volatils dont l’odeur est désagréable.
Ex : modification du goût et de l’odeur du lait, rancissement du beurre.
$\rightarrow$ Pseudomonas, Serratia, Micrococccus, Bacillus, Candida et des moisissures

La flore caséolytique possède des protéases qui hydrolysent les caséines du lait et des produits laitiers. L’hydrolyse des caséines donne un goût amer et âcre au lait. Elle est aussi responsable du ramollissement et du gonflement des fromages.
$\rightarrow$ Pseudomonas, Micrococccus, Bacillus, Proteus et des moisissures

La flore lactique très utile lors des fermentations peut aussi être un agent d’altération. 

• Lactobacillus est responsable du verdissement des viandes et des salaisons conservées sous vide
• Lactobacillus brevis ou Lactobacillus plantarum peut altérer le goût des jus de fruits.
• En brasserie, Pediococcus est responsable d’accidents de fabrication.

La flore acétique peut produire de l’acide acétique lors de la vinification et ainsi altérer le goût des vins.

Le plan de maîtrise sanitaire ($\rm PMS$) est composé :

• De la maîtrise des Bonnes Pratiques d’Hygiène ($\rm BPH$),
• Du plan $\rm HACCP$ qui doit être validé et mis à jour régulièrement,
• D’un système de traçabilité,
• D’un système de gestion des produits non-conformes.

Pour chaque secteur, il existe un guide des Bonnes Pratiques d’Hygiène. Les $\rm BPH$ permettent la mise en place du système $\rm HACC$. Cette méthode $\rm HACCP$ permet de réduire les risques physiques, chimiques et microbiologiques identifiables à des niveaux acceptables dans les entreprises alimentaires. Elle permet de s’assurer de la salubrité des denrées alimentaires c’est-à-dire fabriquer un produit alimentaire sûr et prouver que ce produit alimentaire a été fabriqué de façon sûre. 

Pour cela, le système $\rm HACCP$ :

• Identifie des dangers/risques spécifiques,
• Détermine les points de contrôle,
• Définie les mesures préventives à adopter en vue de maîtriser les risques,
• S’assure que les mesures sont mises en œuvre effectivement et de façon efficace.
  

L’évolution de la flore contaminant les aliments est liée :

• Aux caractères physico-chimiques de l’aliment,
• Aux traitements éventuels auxquels l’aliment a été soumis,
• Aux caractéristiques du microorganisme lui-même.

La microbiologie prévisionnelle permet : 

• De prévoir une modification du produit permettant d’éviter le développement de microorganismes tout en conservant sa qualité marchande,
• De déterminer un niveau de contamination acceptable aux différents points de la chaîne de production.

La méthode consiste à suivre la croissance de microorganismes tests en fonction du temps, dans des conditions définies. Les facteurs influençant la croissance sont le plus souvent, la température, l’activité de l’eau $\rm A_w$ et le pH. Les essais sont alors planifiés selon un plan d’expériences. On mesure alors trois paramètres de la croissance : le temps de latence $\gamma$, taux exponentielle de croissance $\mu$ et la population maximale $\rm N_{max}$ à partir de la courbe $\rm \ln(N) = \mathcal f(t)$.
Dans un second temps, la relation entre chaque paramètre mesuré est les différents facteurs testés est établie.
Ces modèles cinétiques sont ensuite validés puis utilisés pour prévoir l’évolution de la population microbienne dans l’aliment.
Cependant, une étude a priori des risques ne replace pas le contrôle de produits finis !

Les contrôles dans les $\rm IAA$ sont de deux types :

• Les contrôles officiels qui permettent de contrôler la conformité par rapport à un critère, (le Service Commun des laboratoires $\rm SCL$, les laboratoires vétérinaires et l’$\rm IFREMER$)
• Les autocontrôles effectués par un laboratoire interne ou sous-traités. Ce laboratoire peut être accrédité par le $\rm COFRAC$.

Les décrets et les arrêtés relatifs aux critères microbiologiques pour les différentes catégories de produits alimentaires ainsi que les étapes de l’analyse microbiologique (échantillonnage, préparation de l’échantillon, préparation de la suspension mère, dilutions décimales, ensemencement, lecture, interprétation et expression des résultats) sont publiés au Journal Officiel.

Exemples :

Dénombrement des coliformes et des coliformes thermotolérants

Les coliformes sont dénombrés par comptage des colonies : norme $\rm NF~ ISO~ 4832$ de juillet 1991 ou par la technique du nombre le plus probable : norme $\rm NF~ ISO~ 4831$ de juillet 1991.
Selon la norme, les coliformes thermotolérants « présentent les mêmes propriétés caractéristiques que les coliformes après incubation à la température de $\rm 44°C$ ». La présence de coliformes thermotolérants indique la présence présumée d’Escherichia coli qui, à $\rm 44°C$ produit de l’indole à partir du tryptophane (norme $\rm NS~ ISO~ 7251$ de septembre 1994). Escherichia coli est l’espèce la plus spécifique de contamination fécale humaine.
La présence d’Escherichia coli peut être mise en évidence dans les volailles suite à une mauvaise éviscération.

Dénombrement des streptocoques fécaux

Les streptocoques fécaux sont des streptocoques du groupe $\rm D$. Ce sont des coques gram positif en chaînette, catalase négatif. Les Enterococcus sont les plus résistant. Ce sont des témoins de contamination fécale des eaux. Ils sont dénombrés par filtration sur membrane : norme $\rm NF~ T90-416$ d’octobre 1993.

Dénombrement des Clostridium sulfitoréducteurs

Les Clostridium sulfitoréducteurs sont des bacilles Gram positif, anaérobies stricts capables de sporuler. Clostridium perfringens est responsable de toxi-infections alimentaires. Les anaérobies sulfitoréducteurs sont dénombrés sur milieu $\rm TSC$ qui permet de mettre en évidence la réduction des sulfites en sulfure à $\rm 46°C$.

L’interprétation des résultats se fait selon un plan à $2$ classes ou un plan à $3$ classes.

Plan à 2 classes : Deux réponses seulement sont possibles.

• « présence dans» : NON SATISFAISANT ; le produit est déclaré impropre à la consommation.
• « absence dans » : SATISFAISANT 

Ex : Salmonella et Listeria où la norme est : absence dans $\rm 25g$.

Plan à 3 classes 

• $\rm n$ : nombre d’unités composants l’échantillon.
• $\rm m$ : critère fixé par arrêté. 
• $\rm M$ : Seuil limite d’acceptabilité. 
• $\rm c$ : nombre d’unités défectueuses de l’échantillon donnant des valeurs supérieurs à $\rm 3~ m$ lors d’un dénombrement en milieu solide et supérieur à $\rm 10~ m$ lors d’un dénombrement en milieu liquide.

La qualité du lot est considérée comme satisfaisante lorsque les valeurs observées pour les $5$ unités d'échantillon sont $\rm < 3m$ 
$\rm (10m)$

La qualité du lot est considérée comme acceptable lorsque les valeurs observées pour au plus $\rm c$ unités d'échantillon sur $\rm n$ sont comprises entre $\rm 3~ m$ et $\rm M$ ($\rm 10~ m$ et $\rm M$).
Les autres échantillons doivent être $\rm < 3~m$ ($\rm < 10~m$). 

La qualité du lot est considérée comme non satisfaisante

• Dans tous les cas où $1$ d'échantillon présente une valeur supérieure à $\rm M$.
• Ou lorsque plus de c échantillons sur $\rm n$ donnent un résultat supérieur à $\rm 3~m$
  ($\rm 10~m$).

Le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu lorsque la contamination atteint une valeur limite généralement de $\rm 10^3~m$. 

Aussi, les méthodes d’analyse ont été normalisées. Il existe différents organismes de normalisation :

• L’Association Française de Normalisation ($\rm AFNOR$)
• Le Comité Européen de normalisation ($\rm CEN$)
• L’International Standard Organisation ($\rm ISO$)

Ces méthodes sont souvent longues et fastidieuses. Des méthodes alternatives plus rapides et moins lourdes à mettre en œuvre sont alors utilisées dans les laboratoires de contrôles qualités. Ces méthodes peuvent être validées ou non par l’$\rm AFNOR$.