Enzymes

Introduction

Dégradation de l’amidon : $\mathrm{pH = 2}$, chauffage à $100°C$, pendant $2$ heures. OU, quelques secondes, dans la bouche avec simplement de la salive (contenant de l’amylase = enzyme). La première méthode est une catalyse chimique. La seconde méthode est une catalyse enzymatique. 

Faisabilité des réactions chimiques

Si on considère la dégradation du glucose par oxydation : la capacité de $glu$ et $ox$ à réagir ensemble pour donner car et $\mathrm{H_2O}$ est déterminé par l’énergie libre :

$\mathrm{C_6H_{12}O_6 ~(glu) + 6 ~O_2 (ox) \longrightarrow 6 ~CO_2~(car) + 6~H_2O}$

$\mathrm{\Delta G = \Delta G°' + RT\ln \frac{[car]_i [H_2O]_i}{[glu]_{(i)} [ox]_i}}$

Avec : $\mathrm{\Delta G =}$ variation d’énergie libre (en kilojoules par mole), $\mathrm{R =}$ constante des gaz parfaits, $\mathrm{T =}$ température en kelvin et $\mathrm{[X]_i =}$ concentration initiale en composé.

$\mathrm{\Delta G°’}$ est la variation d’énergie standard mesurée pour une température de $\mathrm{298°K}$, à $\mathrm{pH = 7}$, et pour une concentration en chacun des éléments de la réaction (réactif et produit) de $\mathrm{1~mol.L^{-1}}$

• Si $\mathrm{\Delta G > 0 =}$ la réaction est endergonique = la réaction ne pourra se faire que par un apport d’énergie extérieur ;
• Si $\mathrm{\Delta G < 0 =}$ la réaction est exergonique = la réaction libère de l’énergie, elle peut se faire dans le sens dénominateur $\longrightarrow$ numérateur $\mathrm{= glu + ox \longrightarrow}$ car $\mathrm{+ H_2O (-2860 ~kJ.mol^{-1})}$. L’énergie est libérée sous forme de chaleur et de travail (déplacement moléculaire, musculaire,…).

La faisabilité d’une réaction ne présage pas de la vitesse de réaction : l’oxydation du glucose à l’air libre est une réaction lente. Mais il est possible d’utiliser un catalyseur, qui accélère les réactions chimiques. 

Comment accélérer une réaction ? Même si une réaction est exergonique (donc possible), elle nécessite un petit coup de pouce = énergie d’activation (permet de passer la barrière énergétique). Il s’agit de faire passer les molécules d’un état passif à un état excité qui les rend réactives. Cet apport d’énergie n’apparaît pas dans le bilan final de la réaction, car la réaction libère beaucoup plus d’énergie qu’elle n’en consomme. Cette énergie d’activation peut être apportée sous forme de chaleur.

Quel est le rôle du catalyseur ? Il sert à réduire le besoin en énergie d’activation, ce qui permet de démarrer la réaction plus vite. Dans notre exemple, l’oxydation du glucose sera plus rapide avec l’enzyme qu’en conditions naturelles.

Quelles sont les caractéristiques d’un catalyseur ?

• Il ne peut pas rendre possible une réaction endergonique. Il faut définitivement un apport extérieur en énergie. Par couplage avec une réaction très exergonique par exemple ;
• Il augmente la vitesse de la réaction en diminuant la barrière de l’énergie d’activation ;
• Dans le cas de réaction bidirectionnelle, il affecte les vitesses de réaction de la même façon, ce qui implique que l’équilibre est atteint plus vite ;
• Il est intact à la fin de la réaction. Il peut donc resservir immédiatement.

Les enzymes répondent parfaitement à la définition d’un catalyseur : ce sont des catalyseurs biologiques ! Les enzymes sont plus efficaces qu’un catalyseur chimique (voir cas de l’amidon) et agissent en très faible quantité.

Structure des enzymes

Les enzymes sont des protéines qui agissent seules (apoenzymes) ou en partenariat avec un cofacteur = coenzyme (holoenzyme). De nombreuses réactions chimiques emploient le même coenzyme, ce qui fait que la diversité de coenzyme est réduite dans la cellule.

Une enzyme peut être composée : 

• D’une seule protéine : généralement les enzymes sécrétées ;
• De plusieurs protéines = oligomère : l’oligomère est constitué de monomères = protomères = sous-unité (structure quaternaire). Les monomères sont maintenus entre eux par des liaisons faibles. La séparation des protomères conduit souvent à une perte de l’activité enzymatique.

On parle parfois d’isoenzymes = enzymes différentes réalisant la même réaction enzymatique.
Les enzymes vont de $100$ à $1000$ acides aminés, ce qui représente $\mathrm{10~kDa}$ à $\mathrm{100~kDa}$. Certains complexes multienzymatiques ($\neq$ oligomère) peuvent atteindre plusieurs $\mathrm{MDa}$.

Toute la protéine n’intervient pas dans la réaction enzymatique : la réactivité est souvent réduite à une petite portion = site actif. Le site actif est un agencement spatial d’acides aminés, rapprochés par l’acquisition de la structure tertiaire de la protéine. Il participe à :

• La reconnaissance spatiale du substrat de l’enzyme : étape préliminaire de la réaction enzymatique. Des liaisons faibles permettent de stabiliser le substrat au sein du site actif ;
• L’activité catalytique : transformation du substrat en produit.

Les autres acides aminés de l’enzymes participent :

• Au maintien de la structure $\mathrm{3D}$ de la protéine, obligatoire pour conserver le site actif ;
• À la régulation de l’activité enzymatique par fixation de molécules : inhibiteurs ou activateurs.

Spécificité réactionnelle

Une enzyme ne peut catalyser qu’un seul type de réaction chimique. Si elle peut catalyser plusieurs réactions chimiques différentes, c’est un complexe multienzymatique.

Spécificité de substrat, de liaison et de groupe

Substrat : Certaines enzymes sont exclusives à un substrat : elles ne réagissent qu’avec une seule molécule bien définie (uréase et urée). Certaines enzymes reconnaissent une famille de molécule ou sont encore plus généralistes. Distinction entre les isomères optiques $\mathrm{(D/L)}$, les conformations $\alpha/\beta$ chez les glucides, ou les conformations cis/trans ;

• Liaison : les enzymes présentent une spécificité pour les liaisons chimiques (ester, amide,…) ;
• Groupe : les enzymes réagissent généralement avec une fonction bien particulière.

Classification et terminologie

Les enzymes sont classées et nommées en fonction de leur activité : substrat : accepteur-activitéASE

Exemple : xanthine : oxygène oxydoréductase ; aminopeptidase ; $\beta$-1,3-glucanase.

Le suivi de l’activité des enzymes est une nécessité dans le monde des Biotechnologies. Il faut être capable de déterminer précisément la vitesse de réaction et l’affinité d’une enzyme pour son substrat afin d’assurer une démarche de qualité et d’améliorer les processus.

Expressions de l’activité enzymatique

Activité enzymatique : quantité d’enzyme nécessaire pour transformer une certaine quantité de substrat dans le laps de temps défini, dans des conditions définies :

• U : quantité d’enzyme nécessaire pour transformer une µmole de substrat par minute ;
• Katal : quantité d’enzyme nécessaire pour transformer une mole de substrat par seconde.

À partir de ces grandeurs, on définit de nouvelles grandeurs : activité totale, activité spécifique, …

Déroulement d’une réaction enzymatique

Lors d’une réaction enzymatique, plusieurs partenaires sont impliqués : enzyme (E), substrat (S), produit (P) (voir figure).

1. Reconnaissance E-S : rapprochement des substrats (si plusieurs) pour les faire réagir ;
2. Positionnement des substrats au niveau du site actif : placer les substrats dans les meilleures conditions possibles pour les faire réagir. Implication de liaisons faibles. Une modification du site actif est possible dans ces conditions ;
3. Réaction chimique : les chaînes latérales des acides aminés sont généralement mises à contribution dans la réaction  enzymatique ;
4. Relargage des produits ;
5. Retour du site actif dans sa configuration initiale = fixation d’un nouveau substrat possible.

Étude des paramètres cinétiques de la réaction enzymatique

• Réaction de type $\mathrm{A \longrightarrow B : vitesse = k [A]}$, avec $\mathrm{k =}$ constante de vitesse, et $\mathrm{[A] =}$ concentration en $\mathrm{A}$. C’est une réaction de premier ordre.
• Réaction de type $\mathrm{A + B \longrightarrow C : vitesse = k [A] [B]}$. Si $\mathrm{A}$ est en large excès par rapport à $\mathrm{B}$ en début d’expérience, alors $\mathrm{v = k’ [B]}$, avec $\mathrm{k’ = k [A]_0}$. C’est une réaction de second ordre.

En combinant les connaissances sur le déroulement des réactions enzymatiques, et les calculs de vitesse réactionnelle, Brigg-Haldane, puis Michaelis-Menten, ont déterminé les caractéristiques cinétiques d’une réaction enzymatique (voir figure). Le Km est un reflet de l’affinité de l’enzyme pour le substrat : plus il est faible, plus l’enzyme présente une forte affinité pour le substrat.

Représentation graphique de Menten-Michaelis

 $\mathrm{V_0}$ est exprimé en fonction de [S] (voir figure) ;

Représentation graphique de Lineweaver-Burk

On transforme l’équation de Menten-Michaelis en $\mathrm{\frac{1}{V_0}}$ $\mathrm{= \frac{(K_m + [S])}{(V_{max} \times [S])}}$ = $\mathrm{\frac{K_m}{(V_{max} \times [S])} + \frac{1}{V_{max}}}$.

Il s’agit d’une équation de type $\mathrm{y = ax + b}$, si $\mathrm{x = \frac{1}{[S]}}$ et $\mathrm{y = \frac{1}{v_0}}$ (voir figure).

Paramètres influençant la cinétique enzymatique

On suit l’évolution de la valeur de $\mathrm{V_0}$ en fonction des paramètres physiques du milieu :

Température : de $\mathrm{0°C}$ à $\mathrm{40°C}$, augmentation progressive de la $\mathrm{v_0}$, jusqu’à un maximum, la température optimale. Cette augmentation est liée à la diminution de la barrière d’activation de la réaction enzymatique. Cette valeur dépend du pH, de la force ionique, etc. Au-delà de la température optimale, l’activité de l’enzyme décroît très vite en raison de la dénaturation de l'enzyme par l’agitation thermique (= destruction des liaisons).

pH : le pH va modifier le degré de ionisation de l’enzyme et du substrat, agissant ainsi les interactions ioniques entre les molécules : conformation structurale du site actif, attraction enzyme-substrat, activité des acides aminés catalytiques. Ceci peut améliorer ou réduire l’efficacité de l’enzyme. Il existe un pH optimum, et plus on s’éloigne de cette valeur, plus on décroît l’efficacité de l’enzyme (diminution de $\mathrm{v_0}$).

Concentration en enzyme : si l’on prend en compte l’équation de Menten-Michaelis, $\mathrm{v_0}$ dépend directement de la concentration en enzyme $\mathrm{[E]_0}$. Plus elle augmente, plus $\mathrm{v_0}$ augmente. Il existe des limites : la solubilité de l’enzyme en solution, et si $\mathrm{[E]_0}$ devient trop proche de $\mathrm{[S]}$ alors la modélisation de Menten-Michaelis n’est plus applicable.

Le cas des inhibiteurs

Inhibiteurs : molécules qui se fixent sur l’enzyme et diminuent ou abolissent la vitesse initiale de la réaction. Il en existe deux types : les inhibiteurs réversibles et les non-réversibles. Nous nous intéresserons uniquement aux inhibiteurs réversibles.

Les inhibiteurs réversibles sont répartis en deux groupes en fonction de leur mode d’action :

• Les compétitifs : ils prennent la place du substrat (analogue structural) sur le site actif et bloque la création du complexe $\mathrm{E-S}$ par formation d’un complexe $\mathrm{E-inhibiteur ~(I)}$. Ceci modifie la valeur de $\mathrm{K_m}$ mais ne modifie pas la valeur de $\mathrm{v_{max}}$ (voir figure : droite verte). L’inhibition compétitive est très utilisée dans le domaine pharmaceutique pour bloquer le développement de parasites ou d’agents pathogènes ou dans la lutte contre les cancers (antimétabolites).
• Les non-compétitifs : ils empêchent le fonctionnement du site actif mais ils ne se fixent pas dessus ! Un troisième état apparaît alors, avec $\mathrm{E-S}$ et $\mathrm{E-I}$, il s’agit d’$\mathrm{EIS}$, qui est inactif malgré la fixation d’un substrat. La valeur de $\mathrm{K_m}$ n’est pas modifiée (puisque pas d’interaction entre le substrat et l’inhibiteur) mais la valeur de $\mathrm{v_{max}}$ diminue (voir figure : droite rouge).

L’allostérie

Certaines enzymes participant à des voies de biosynthèse peuvent être inhibées par le produit final de la voie. Ce produit se fixe alors sur l’enzyme, mais sur un site distinct du site actif : un autre site (= allostérique).

Ces enzymes ne répondent pas à la loi de Menten-Michaelis : la représentation graphique est alors une sigmoïde, ce qui met en évidence un phénomène coopératif lors de la fixation du substrat = le premier substrat fixé favorise la fixation des suivants. Evidemment, il s’agit exclusivement de complexes oligomériques (plusieurs protéines) : il y a donc plusieurs sites actifs. Il peut arriver que chaque protomère conserve une activité enzymatique, une fois séparé du groupe, et que sa cinétique suive la loi de Menten-Michaelis. Le modèle le plus connu d’allostérie est l’hémoglobine.