L'ADN et sa réplication

La réplication de l’$\mathrm{ADN}$ consiste à produire une copie de l’$\mathrm{ADN}$ existant. Cette réaction est réalisée en amont de la division cellulaire : la cellule va former deux cellules-filles, chacune possédant une copie du pool d’$\mathrm{ADN}$ de la cellule-mère.

Modélisation

Les travaux de Meselson et Stahl (utilisation d’azote lourd) ont montré que la réplication est semi-conservative : les deux brins d’$\mathrm{ADN}$ sont séparés et chacun des brins sert de matrice à la synthèse d’un nouveau brin. À la fin, les deux molécules d’$\mathrm{ADN}$ produites sont constituées chacune d’un brin ancien et d’un brin nouveau.

Les travaux de Cairns ont confirmé les travaux précédents : il a observé, chez E. coli, le déroulement de la réplication du chromosome bactérien. Pour cela, il a fourni de la thymine marquée, puis a figé les cellules à différents temps. Après révélation par autoradiographie, il a observé que le chromosome bactérien se séparait progressivement en deux molécules et que chacune d’elle servait de matrice à la synthèse d’un nouveau brin.

Les travaux de Cairns ont montré une zone de séparation des deux brins d’$\mathrm{ADN}$ à répliquer : l’œil de réplication. Cette zone s’agrandit au cours du temps, jusqu’à séparer les deux brins. Cette zone s’agrandit vers la droite et la gauche : la réplication est bidirectionnelle.

Les acteurs de la réplication

Ils sont fondamentalement les mêmes chez les Procaryotes ($\mathrm{ProK}$) et les Eucaryotes ($\mathrm{EuK}$), seules les structures changent ou le nombre d’intervenants :

Brin d’ADN : le brin d’$\mathrm{ADN}$ orienté $3’ \rightarrow 5’$ sert de matrice ;

ADNpolymérase : elle synthétise le nouveau brin d’$\mathrm{ADN}$ en utilisant l’un des anciens brins comme matrice. Elle respecte le principe de complémentarité des bases. Il en existe trois modèles chez les $\mathrm{ProK ~(ADNpol ~I, ~II ~et ~III)}$ et douze chez les $\mathrm{EuK}$. Elle nécessite une zone double-brin sur le brin à répliquer (amorce d’$\mathrm{ARN}$), et ajoute des nucléotides triphosphates libres, dans le sens $5’ \rightarrow 3’ =$ elle fixe le $\mathrm{5’-phosphate}$ d’un nucléotide libre sur le $\mathrm{3’-OH}$ d’un nucléotide déjà en place. La libération de pyrophosphate ($\mathrm{PP}$) libère l’énergie nécessaire à cette liaison ester-phosphorique ;

Désoxyribonucléotides ($\mathrm{dnt}$) libres : $\mathrm{dATP, dGTP, dTTP ~et ~dCTP}$ sont les briques de la nouvelle molécule. Lors de leur incorporation, ils perdent deux phosphate (=pyrophosphate), ce qui est très énergétique ;

Hélicase : enzyme hexamèrique qui sépare les deux brins d’$\mathrm{ADN}$ à répliquer. Elle se place à la fourche de réplication et se fixe sur l’un des brins : elle hydrolyse de l’$\mathrm{ATP}$ pour pouvoir séparer les deux brins au cours de la progression de l’ADNpolymérase ;

Primase : enzyme qui met en place l’amorce d’$\mathrm{ARN}$ sur le brin matrice, afin que l’ADNpolymérase puisse s’installer. Elle reconnait les yeux de réplication et synthétise de petits $\mathrm{ARN ~(15-30 ~nt) =}$ cela forme localement un hétéroduplex $\mathrm{ADN-ARN}$. Il sera éliminé ultérieurement et remplacé par de l’$\mathrm{ADN}$ ;

Topoisomérase : enzyme placée au niveau de la fourche qui permet le débobinage de la molécule d’$\mathrm{ADN}$ à répliquer, en consommant de l’$\mathrm{ATP}$. Faites l’expérience chez vous : essayer de séparer en deux un ruban de papier, très enroulé (type ruban de cadeau). Les deux rubans vont se pelotonner et bloquer la séparation. La topoisomérase permet de couper temporairement un des brins, de le faire tourner librement autour de l’autre pour limiter la formation de la pelote. Elle ressoude ensuite le brin.

Protéines stabilisatrices ($\mathrm{SSB =}$ single-strand binding proteins) : enzymes qui se placent entre la fourche et l’ADNpolymérase pour stabiliser la section de brin matrice encore simple brin.

Déroulement de la réplication chez les Procaryotes (voir figure)

Initiation : ouverture du chromosome bactérien au niveau d’une séquence bien définie (oriC). Mise en place de l’hélicase qui sépare les deux brins et des $\mathrm{SSB}$ qui empêche leur réunion ;

Elongation : mise en place des amorces d’$\mathrm{ARN}$ par la primase. Installation de l’ADNpolymérase qui synthétise alors deux types de brins :

• Brin direct (précoce) : brin synthétisé à partir du brin matrice $3’ \rightarrow 5’$. Il s’agit d’une synthèse continue, comme présentée précédemment ;
• Brin retardé (tardif) : multiples petits brins (fragments d’Okazaki), synthétisés sur le brin matrice orienté $5’ \rightarrow 3’$. A la fin de l’élongation les brins seront réunis entre eux grâce à une ADNligase, pour former un brin continu.

Dans chaque œil de réplication, on trouve $4$ ADNpolymérases : deux par fourche = une pour le brin direct et une pour le brin retardé de chaque côté de l’œil.

Une $\mathrm{RNase ~H}$ va éliminer le brin d’$\mathrm{ARN}$ ayant servi d’amorce et il sera remplacé par un brin d’$\mathrm{ADN}$ équivalent.

Terminaison : mécanisme mal-connu, impliquant un complexe de terminaison (non-élucidé).

Déroulement de la réplication chez les Eucaryotes

Le déroulement de la réplication est sensiblement le même. Quelques différences sont notables :

• La réplication n’a lieu que durant la phase $\mathrm{S}$ du cycle cellulaire chez les $\mathrm{EuK}$, alors qu’elle dure quasiment tout le cycle chez les $\mathrm{ProK}$ ;
• L’$\mathrm{ADN}$ des $\mathrm{Euk}$ étant beaucoup plus long, il existe plusieurs sites d’initiation et donc de très nombreux yeux de réplication ($1$ pour $\mathrm{100 ~000 ~nt}$). Il est unique chez les ProK. Les multiples yeux se rejoignent et séparent la molécule-mère en deux molécules-filles ;
• Au fur et à mesure de la synthèse des nouveaux brins d’$\mathrm{ADN}$, les histones se mettent en place pour former la chromatine.

Vérification de la réplication

Au cours de la réplication, il peut y avoir des erreurs. Elles sont liées au comportement des base qui peuvent former des tautomères (voir figure). La thymine, guanine et adénine peuvent s’apparier différemment :

• Le tautomère de thymine peut s’apparier avec la guanine ;
• Le tautomère de guanine peut s’apparier avec la thymine ;
• Le tautomère de l’adénine peut s’apparier avec la cytosine.

Ce mésappariement va introduire des changements ponctuels dans la séquence, ce qui peut modifier le sens de l’information génétique (mutation). Il existe des mécanismes de correction : chez les $\mathrm{ProK}$, l’ADNpolymérase I se place à l’extrémité $3’$ du brin néoformé. Elle possède :

• Une activité exonucléasique $3’ \rightarrow 5’$, qui remonte la séquence et élimine les mésappariements ;
• Une activité polymérase $5’ \rightarrow 3’$ qui remplace les mésappariements éliminés.