Parmi les outils essentiels en biologie moléculaire, on trouve les enzymes de restriction. Ce sont des endonucléases d’origine bactérienne qui coupent à l’intérieur de l’ADN au niveau de séquences palindromiques. Le site de coupure est appelé « site de restriction ». Les trois premières lettres du nom de l’enzyme indiquent la bactérie d’origine.
Parmi les techniques essentielles en biologie moléculaire, on trouve la PCR : (Polymerase Chain Reaction). Elle permet d’amplifier une séquence d’ADN en utilisant une enzyme et en mimant in vitro la réplication.
Le cycle se déroule en 3 phases :
- Dénaturation (autour de 95°C). La température va rompre les liaisons hydrogène qui maintenaient les bases azotées entre elles. Les deux brins d’ADN vont se séparer.
- Hybridation (autour de 55°C). Des amorces sont apportées dans le milieu réactionnel. Ce sont des courts fragments qui vont border la séquence d’ADN à amplifier. Elles sont indispensables pour que l’ADN polymérase réplique l’ADN matriciel.
- Elongation (72°C). L’ADN polymérase va répliquer le brin d’ADN matriciel en respectant la loi de complémentarité des bases. L’enzyme utilisée est la Taq polymérase qui résiste à des températures élevées.
Plusieurs cycles s’enchainent. Ce qui permet une amplification exponentielle du brin d’ADN initial.
D’autres techniques d’amplification basées sur le clonage moléculaire mettent en jeu des cellules qui vont amplifier le fragment d’ADN. Afin qu’il soit amplifié, il est au préalable, associé à un vecteur (plasmides, phages, BAC, YAC). Plusieurs étapes sont nécessaires :
- Digestion du vecteur et de l’ADN portant la séquence d’intérêt (insert) par des enzymes de restriction
- Ligation de l’insert dans le vecteur par une ADN ligase.
- Transformation des cellules compétentes : pénétration de l’ADN recombiné dans une cellule hôte.
- Amplification in vivo en mettant en culture la cellule hôte dans des conditions optimales.
- Sélection des cellules qui possèdent le vecteur.
- Criblage pour repérer les cellules qui possèdent le vecteur avec l’insert.
Les intérêts de l’amplification de gènes sont multiples :
- A des fins thérapeutiques
- Pour la production d’OGM (organismes génétiquement modifiés)
- Pour le séquençage
- Pour le diagnostic
- A des fins d’enquêtes judiciaires…
